測定意義: LPS又稱甘油酯水解酶,催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油(或者甘油二酯和單酯)。LPS廣泛的存在于各種生物中。血清中LPS的異常增高常見于胰腺炎和胰腺癌。 測定原理: LPS催化油酯水解成脂肪酸,利用銅皂法測定脂肪酸生成速率,即可計算LPS活性。 自備儀器和用品: 研缽、臺式離心機(jī)、震蕩混勻器、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、甲苯、無水乙醇、冰和蒸餾水。 試劑組成和配制: 試劑一:液體×2瓶,4℃保存。 試劑二:液體×1瓶,室溫保存。 試劑三:液體×1瓶,4℃保存。 標(biāo)準(zhǔn)品×1瓶,10 µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,室溫保存。臨用前加入3.168 mL無水乙醇,充分溶解。 粗酶液提取: 稱取約0.1g樣品,加試劑一1 mL充分研磨,16000rpm 4℃離心40min,取上清液待測。 LPS測定操作: - 分光光度計預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長到710 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一和試劑二置于37℃水浴預(yù)熱30min以上。 3. 空白管:取1.5 mL EP管,依次加入150μL試劑一和50μL試劑二,反復(fù)震蕩混勻;加入5μL蒸餾水,迅速震蕩混勻后置于37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10 min;加入400μL甲苯,反復(fù)震蕩混勻后,室溫4000rpm離心10min;取出離心管,小心吸取上層溶液200μL,加入另一1.5mL EP管,再加入50μL試劑三,反復(fù)震蕩混勻;室溫4000rpm離心10min,小心吸取上層溶液150μL,加入微量石英比色皿/96孔板,于710nm處測定吸光值。記為A空白管。 4. 標(biāo)準(zhǔn)管:取1.5 mL EP管,依次加入150μL試劑一和50μL試劑二,反復(fù)震蕩混勻;加入5μL標(biāo)準(zhǔn)品,迅速震蕩混勻后置于37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10min;加入400μL甲苯,反復(fù)震蕩混勻后,室溫4000rpm離心10min;取出離心管,小心吸取上層溶液200μL,加入另一1.5mL EP管,再加入50μL試劑三,反復(fù)震蕩混勻;室溫4000rpm離心10min,小心吸取上層溶液150μL,加入微量石英比色皿/96孔板,于710nm處測定吸光值。記為A標(biāo)準(zhǔn)管。 5. 測定管:取1.5mL EP管,依次加入150μL試劑一和50μL試劑二,反復(fù)震蕩混勻;加入5μL上清液,迅速震蕩混勻后置于37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10min;加入400μL甲苯,反復(fù)震蕩混勻后,室溫4000rpm離心10min;取出離心管,小心吸取上層溶液200μL,加入另一1.5mL EP管,再加入50 μL試劑三,反復(fù)震蕩混勻;室溫4000rpm離心10 min,小心吸取上層溶液150 μL,加入微量石英比色皿/96孔板,于710nm處測定吸光值。記為A測定管。 LPS活性計算: a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下 (1)按蛋白濃度計算 活性單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/mg prot) =[V反總×C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷(Cpr×V樣÷V樣總) ÷T=0.1×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr (2)按樣本鮮重計算 活性單位定義:37℃中每克樣品每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/g 鮮重) =[ V反總×C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=0.1×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W C標(biāo)準(zhǔn)品:10 µmol/mL;V標(biāo)準(zhǔn)品:加入反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.005 mL;V反總:反應(yīng)體系總體積,205μL=2.05×10-4L;V樣總:上清液總體積,1 mL;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.005 mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;T:催化反應(yīng)時間,10 min。 b.使用96孔板測定的計算公式如下 (1)按蛋白濃度計算 活性單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/mg prot) =[V反總×C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷(Cpr×V樣÷V樣總) ÷T=0.1×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr (2)按樣本鮮重計算 活性單位定義:37℃中每克樣品每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/g 鮮重) =[ V反總×C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=0.1×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W C標(biāo)準(zhǔn)品:10 µmol/mL;V標(biāo)準(zhǔn)品:加入反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.005 mL;V反總:反應(yīng)體系總體積,205μL=2.05×10-4L;V樣總:上清液總體積,1 mL;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.005 mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;W :樣品質(zhì)量;T:催化反應(yīng)時間,10 min。 注意事項: 1、甲苯有毒,實驗過程中需佩戴手套和口罩。 2、實驗過程中須遠(yuǎn)離火源。 |